實(shí)驗(yàn)方法原理

主要由兩個(gè)部分組成，第一部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的測(cè)定過程；第二部分即通常的PCR檢測(cè)，抗原分子的量最終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。第一步中，首先用待測(cè)抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19（質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19）中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，第一步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時(shí)內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。

PCR由以下五部分構(gòu)成：

（1）待測(cè)抗原；

（2）生物素化抗體；

（3）親和素（連接分子）；

（4）生物素化DNA；

（5）PCR擴(kuò)增。

主要程序：

（1） 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；

（2） 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；

（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；

（4） PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。

實(shí)驗(yàn)材料抗原樣品

試劑、試劑盒包被緩沖液洗滌液稀釋液瓊脂糖凝膠

儀器、耗材微滴板電泳儀電泳槽

實(shí)驗(yàn)步驟

一、制備生物素化DNA

 將噬粒 BLuescript skt，用生物素標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段，即為生物素化DNA。

二、免疫PCR模式

 1.  試劑

 包被緩沖液：20 mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN3；

 洗滌液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20；

 稀釋液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/L NaCl 0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1 mg/ml）。

2.  操作

 1） 包被

 用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45 μl孔），4℃過夜（約15 h），用洗滌液洗板3次×5 min。

 2） 封閉

 每孔加200 μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1 mg/ml）、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150 mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80 min，洗板數(shù)次。

 3） 抗原抗體反應(yīng)

 用釋釋液1:8 000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50 μl，室溫（22℃）下45 min，洗板孔15次×10 min，去除未結(jié)合的抗體分子。

 4） 鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng)

 每孔加入50 μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50 min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10 min，再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。

 5） PCR

 實(shí)驗(yàn)條件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5 mmol/LMgCl2、明膠（10 μg/ml）、0.8 mmol/LdNTPs（每種0.2 mM）、2 μM引物（每一引物1 μM）和TaqDNA多聚酶（50 U/ml）。

三、PCR周期

 PCR前，用紫外線（UV）（254 nm）照射上述反應(yīng)混合物，然后將之加入到微滴板孔中，每孔40 μl，再加20 μl UV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進(jìn)行PCR周期：起始變性94℃5 min；30個(gè)周期：變性94℃5 min，退火58℃1 min，延伸72℃1 min，最后延伸72℃ 5 min，得到的PCR產(chǎn)物為特定的261 bp的片段。

 1.  用0.85% NaCl將細(xì)菌溶液稀釋至一定濃度；

 2.  加50 μl于微孔板內(nèi)，4℃過夜。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（加50 μl 0.85% NaCl于另一孔內(nèi)）；

 3.  用400 μl的0.05% 溫20pBS（以下簡(jiǎn)稱TPBS），洗滌五次；

 4.  加入2.25%的100 μl正常山羊血清（NGS） PBS封閉2小時(shí)； 

⒌  用含0.15% NGS的TPBS洗3次；

6.  加入100 μl用0.75% NGS適當(dāng)稀釋的單克隆抗體（內(nèi)含100 μg的鮮魚精DNA），室溫孵育30 min；

7.  用TPBS洗滌五次；

8.  加入50 μl適量稀釋的生物素化抗鼠IgG抗體，室溫孵育30 min；

9.  用TPBS洗滌五次；

10.  加入60 μl適量稀釋的生物素化DNA和親和素，室溫孵育30 min；

11.  用TPBS洗滌五次，再用HPLC級(jí)水洗三次；

12.  PCR擴(kuò)增：加入50μl PCR反應(yīng)液（內(nèi)含T3和T7引物），95℃ 60 s，50℃ 110 s，72℃ 110 s，循環(huán)30次。取PCR產(chǎn)物10 μl于1.7%瓊脂糖凝膠上電泳，和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較，在相應(yīng)的位置郵現(xiàn)電泳帶為陽性。必需時(shí)將電泳結(jié)果照像，進(jìn)行定量分析。