孵育滲透脆性檢測試劑盒(比色法)也稱紅血球，是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，脊椎動(dòng)物體內(nèi)通過RBC運(yùn)送氧氣，

RBC同時(shí)還具有免疫功能，在貧血檢查中可通過紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)來檢測紅細(xì)胞膜的缺陷。

(Erythrocyte Incubated Osmotic Fragility Assay Kit )檢測原理是將患

者血液置于37℃孵育24h，使紅細(xì)胞代謝繼續(xù)進(jìn)行，由于葡萄糖的消耗，儲備的ATP減少，導(dǎo)致需要能量的紅細(xì)胞膜對陽離

子的主動(dòng)傳遞受阻，造成鈉離子在紅細(xì)胞內(nèi)聚集，細(xì)胞膨脹，孵育滲透脆性增加，某些有細(xì)胞膜缺陷以及某些酶缺陷的紅細(xì)

胞的葡萄糖和ATP很快被耗盡時(shí)，孵育滲透脆性明顯增加，該實(shí)驗(yàn)被稱為紅細(xì)胞孵育滲透脆性試驗(yàn)，主要用于檢測人、

動(dòng)物血液的紅細(xì)胞孵育滲透脆性，并計(jì)算紅細(xì)胞中性脆性(MCF)。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

三、自備材料：

1、離心管或小試管

2、蒸餾水

3、酶標(biāo)儀、96孔板

四、操作步驟(僅供參考)：

1、配制組織勻漿液(1×)∶取10ml組織勻漿液(3×)加入20ml蒸餾水即成。

2、配制PA Assay Buffer (1x)∶取10ml PA Assay Buffer (1.5×)加入5ml蒸餾水即成。

3、準(zhǔn)備樣品︰

①血清、尿液及其他體液樣品:血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，尿液通常也可以直接用于測定，-20°C凍存。

②組織樣品︰稱取1g組織樣品置于勻漿器中，再加入1ml組織勻漿液(1x)仔細(xì)研磨，振搖提取靜置30min ,取上清液4000rpm離心10min ,取上清液,用組織勻漿液(1×)定容至2ml , -20℃凍存，用于PA的檢測。

③植物材料︰稱取1g植物材料置于勻漿器中，再加入1ml組織勻漿液(1×)仔細(xì)研磨，振搖提取,靜置30min ,取上清液4000rpm離心10min ,取上清液,用組織勻漿液(1×)定容至2ml , -20℃凍存，用于PA的檢測。

④高濃度樣品:如果樣品中含有較高濃度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等進(jìn)行稀釋，如雞血清可稀釋5～10倍后檢測。

4、配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液︰如果檢測血清、尿液等樣品，按取丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(6mg/ml):蒸餾水=1：99的比例配制，使?jié)舛冗_(dá)到60μg/ml，如果檢測組織樣品按丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(6mg/ml) :組織勻漿液(1×)=1:99的比例配制，使?jié)舛冗_(dá)到60μg/ml。

注意事項(xiàng):

1、實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即使用，應(yīng)存于-20°C.

2、實(shí)驗(yàn)用蒸餾水不能含有二氧化碳，可用新煮沸且冷卻后的蒸餾水，并蓋緊口。

3、TA滴定液為堿性溶液，有腐蝕性，請小心操作。

4、TA標(biāo)定液容易長菌，宜4℃保存，一旦發(fā)現(xiàn)有絮狀物請棄用。

5、果實(shí)中含酸量較少時(shí)可將TA滴定液適當(dāng)稀釋后使用，可考慮用0.01~0.05M  TA滴定液進(jìn)行滴定。

6、TA滴定液含量計(jì)算公式中，V0最好為3次空白測定的平均值。

7、如果所測樣品的濃度過高，應(yīng)用TA Lysis Buffer工作液稀釋樣品后重新測定，并將稀釋倍數(shù)帶入公式。

8、如果樣品顏色較深，滴定終點(diǎn)不易觀察，應(yīng)采用電位滴定法。

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